在细菌日益耐药的今天，噬菌体疗法有望成为抗生素的替代疗法。大多数精心设计的噬菌体治疗研究仅存在于动物模型中。虽然这些动物治疗模型不能替代人体临床试验，但能提供很多宝贵的信息，如对不同感染部位、不同细菌，使用噬菌体的剂量和治疗时间选择；噬菌体药代动力学；噬菌体免疫原性、安全性等。为了促进人体噬菌体临床试验，了解这些动物治疗模型怎样实施及如何改进是很重要的。
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噬菌体治疗动物模型的构建
与在细菌接种时或接种前给予噬菌体的预防措施不同，噬菌体治疗是在给动物通过适当途径（如肺炎模型通过滴鼻）接种已知剂量的细菌，建立感染后再给予噬菌体。研究人员通常会设定一个终点（如48小时内%的动物病死率），以便确定在随后的噬菌体治疗实验中使用合适细菌剂量，这通常需要进行不同剂量的实验。噬菌体在给药前需要经过多个步骤的准备。像小鼠只能耐受小剂量的液体，特别是静脉或鼻腔给药时。因此，必须浓缩噬菌体以达到预定的治疗浓度。噬菌体治疗浓度取决于所期望的感染复数（multiplicityofinfection，MOI），即病*（PFU）与细菌（CFU）数量的比率。例如，如果动物接种了10^8cfu的细菌并且需要的MOI，那么接受治疗的噬菌体浓度必须达到10^10pfu。实验通常还要采用额外的步骤清除内*素，内*素是一种从革兰氏阴性菌细胞壁释放的脂多糖，不论对动物还是人体均具有极高的*性。对于噬菌体治疗，所有这些步骤都是至关重要的，以确保给药前噬菌体的纯度、均一性和安全性。
图1噬菌体治疗动物模型的应用[1]
针对不同感染模型，噬菌体给药方式多样，如口服，静脉、腹腔内、皮下、肌肉注射，滴鼻，气管雾化吸入，局部湿敷等。给药方式的选择影响治疗效果，对于某些感染模型，即使噬菌体浓度足够也会导致治疗失败，例如静脉或者腹腔内注射噬菌体，不能治愈铜绿假单胞菌引起的肺炎，只有噬菌体滴鼻或雾化吸入有效[2]。给药浓度、噬菌体种类的选择在治疗动物感染模型中也非常重要。较高的MOI能够更有效地杀死细菌，但到达一定阈值后不存在进一步的效果，MOI通常在1到0之间。多种噬菌体的组合提供了更广泛的杀菌效果，并可能通过靶向不同的宿主受体来缓解噬菌体抗性的出现。
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常用的动物模型
噬菌体治疗中常用的动物模型包括常见的脊椎动物，小鼠、兔、鸡、斑马鱼等；非脊椎动物如线虫、果蝇、大蜡螟。每种动物因其特有的属性，对不同细菌的易感程度不同，且对细菌感染不同的部位也会有影响。因此，合理选择适当的动物模型，对于噬菌体治疗实验结果的准确性和可靠性至关重要。
图2应用于噬菌体治疗的动物模型[3]
在非脊椎动物感染模型中，昆虫有其复杂的先天免疫系统，与哺乳动物高度相似。此外，它们被认为是大型哺乳动物细菌定植研究的合适替代模型，以及抗菌素药代动力学研究的优秀工具。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）是一种体型较小的线虫（1毫米长），容易被细菌、真菌和病*感染。能够感染秀丽隐杆线虫的病原体包括人类常见的细菌，如铜绿假单胞菌。线虫的感染很容易实现，因为它们的营养来源是细菌，因此病原体主要在肠道定植，噬菌体可以通过同样的给药途径传递。Augustine等人（FEMSMicrobiol.Lett.）和Glowacka-Rutkowska等人（Front.Microbiol.）建立了肠炎沙门氏菌和金*色葡萄球菌感染的线虫模型和噬菌体治疗应用。在这两种情况下，噬菌体的使用都使感染幼虫的存活率显著增加。在噬菌体处理h后，恢复的线虫产生了健康的后代。尽管这两项研究将死亡率作为测试噬菌体功能的唯一指标，但结果表明线虫可以成为噬菌体治疗研究中有用的动物模型。另一种用于细菌感染和噬菌体治疗的无脊椎动物，大蜡螟（Galleriamellonella）。在Seed等人（Antimicrob.AgentsChemother.）的一项研究中，不同的噬菌体有效地应用于治疗大蜡螟幼虫的洋葱伯克霍氏菌感染。作者还讨论了在处理过的幼虫中观察到的保护性是噬菌体的作用，而不是由噬菌体注射引发的宿主免疫反应。他们发现热灭活的噬菌体可以激活免疫系统，但不能提高幼虫的存活率，这表明抗菌作用依赖于活性噬菌体的增殖。有趣的是，两项针对大蜡蛾幼虫的不同研究也报告了注射或口服噬菌体鸡尾酒的预防效果。在Nale等人（Front.Microbiol.）所做的第一项研究中，一种能够破坏艰难梭菌生物膜的四种噬菌体混合物添加到幼虫食物中时，能够有效提高存活率，防止细菌定植。Forti等人（Antimicrob.AgentsChemother.）在进行的第二项研究中，最初用于预防大蜡螟中铜绿假单胞菌感染的六种噬菌体混合物有效地抵消了小鼠的肺部感染。这一结果表明，相同的噬菌体可以在不同的物种中发挥作用，包括无脊椎动物和脊椎动物。斑马鱼作为研究宿主-细菌相互作用的模型，尤其是在其胚胎期，正受到越来越多的青睐。胚胎发育成熟的先天免疫系统、遗传易变性和光学透明度使其与传统动物模型对比，有着独特的优势。近年来，人们建立了一些斑马鱼模型，研究粪肠球菌、铜绿假单胞菌等细菌感染的噬菌体治疗应用。斑马鱼胚胎的全身感染是通过在血液循环中注射细菌，噬菌体治疗通过同样的给药途径。被感染斑马鱼胚胎的存活率增加证明了噬菌体治疗的成功，它们从细菌感染引起的形态改变中恢复，并且胚胎中细菌定植减少。斑马鱼模型应用于噬菌体治疗研究，大大降低了实验成本和时间周期。要将噬菌体疗法应用于人类，还必须使用更高层次的脊椎动物模型进行研究。在哺乳动物中，小鼠模型是研究噬菌体疗法最常用的模型。由于与人类的高度相似性，它们不仅被用于证明经典噬菌体治疗的有效性，还被用于研究噬菌体与宿主免疫系统之间的相互作用。与小鼠相反，兔子天生就会受到金*色葡萄球菌感染的折磨，是研究这种细菌的合适动物模型。Kishor等人（IndianJ.Med.Res.）研究中，噬菌体疗法在金*色葡萄球菌感染的兔模型中进行了试验。尽管作者证明了噬菌体治疗细菌感染的可行性，但兔模型不同于细菌慢性感染的情况，在常规治疗方法失败后才应用噬菌体治疗。在禽类中，口服噬菌体用于预防或感染后治疗，以对抗沙门氏菌、大肠杆菌和弯曲菌的感染，这些感染在家禽中是一个世界性的经济和健康问题。图3小鼠伤口感染的噬菌体治疗[4]
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动物模型的局限性
动物模型与真正的噬菌体临床治疗存在一些差别。与已知细菌感染的动物实验不同，临床上的感染往往由数量无法量化的细菌引起的，这就导致了在人体中使用精确MOI的噬菌体剂量很困难。人体感染的细菌数量可能远超任何动物实验中使用的细菌数量，如果试图模仿动物实验的MOI，这将需要比这些实验更大剂量的噬菌体。然而，许多在临床治疗中使用的噬菌体接种剂量与在动物中使用的相当。例如，在Schooley等人（Antimicrob.AgentsChemother.）治疗弥散性鲍曼不动杆菌感染时，静脉注射噬菌体剂量是5*10^9PFU，而Law等人（Infection.）使用4*10^9PFU的噬菌体剂量成功治疗囊性纤维化患者感染的铜绿假单胞菌。然而，基于噬菌体能够通过感染细菌自我复制的特性，在人体中使用高MOI可能是不需要的。与人类感染相比，动物模型的感染进展速度也有所不同。在大多数动物模型中，实验性感染进展迅速，在没有噬菌体治疗的情况下，通常在48至72小时内杀死动物。因此，治疗这些动物感染需要在细菌接种感染后立即给药。由于人类感染的进展速度很少像这些动物模型中的感染那样快（如肺炎患者可能医院就诊），在人体身上进行噬菌体治疗可能要经过一段延迟时间，临床治疗的显著延迟限制了动物模型的应用。一些动物研究成功重现了人类感染的延迟情况，特别是Waters等人（Thorax.）建立的慢性铜绿假单胞菌肺炎模型和Capparelli等人（AgentsChemother.）建立的非致死金*色葡萄球菌菌血症模型。我们需要更多这样的慢性感染模型，尤其是肺炎和全身感染，能让动物在不接受治疗的情况下存活至少5或7天，并且在延迟一段时间后给予噬菌体治疗仍可治愈。
结语
抗生素的耐药性使得噬菌体疗法成为替代疗法变得迫在眉睫，在动物模型上的研究应该作为在临床治疗中应用噬菌体疗法的指南。许多动物模型数据表明了噬菌体疗法的有效性，然而还有很多东西需要探究，如方案的标准化、药代动力学建模的优化以及精确模拟人类感染时间过程。展望未来，如果我们希望将噬菌体疗法引入到21世纪的常规临床实践中，而噬菌体治疗动物模型需要提前解决这些问题。
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参考文献
1.Cieslik,M.,Baginska,N.,Gorski,A.Jonczyk-Matysiak,E.()AnimalModelsintheEvaluationoftheEffectivenessofPhageTherapyforInfectionsCausedbyGram-NegativeBacteriafromtheESKAPEGroupandtheReliabilityofItsUseinHumans,Microorganisms.9.
2.Chang,R.Y.K.,Chen,K.,Wang,J.,Wallin,M.,Britton,W.,Morales,S.,Kutter,E.,Li,J.Chan,H.K.()Proof-of-PrincipleStudyinaMurineLungInfectionModelofAntipseudomonalActivityofPhagePEV20inaDry-PowderFormulation,AntimicrobAgentsChemother.62.
3.Brix,A.,Cafora,M.,Aureli,M.Pistocchi,A.()AnimalModelstoTranslatePhageTherapytoHumanMedicine,IntJMolSci.21.
4.TaatiMoghadam,M.,Khoshbayan,A.,Chegini,Z.,Farahani,I.Shariati,A.()Bacteriophages,aNewTherapeuticSolutionforInhibitingMultidrug-ResistantBacteriaCausingWoundInfection
essonfromAnimalModelsandClinicalTrials,DrugDesDevelTher.14,-.
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撰文：李建辉
编辑：李建辉
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｜人类肠道的噬菌体组：微生物组——“已知中的未知”
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｜细菌对噬菌体耐受或许有助于噬菌体治疗
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｜噬菌体治疗不同给药方式的比较（I）
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